rna电泳RNA提取电泳注意事项

娱乐频道 2020-02-11172未知admin

  RNA提取电泳注意事项_生物学_自然科学_专业资料。心之所向,所向披靡 imingxian 提取 RNA 及用 DEPC 去除 RNase 的个人总结 快速的操作,低温,少量取上清 主要是抽提之后吸取上清时要特别小心,只要不把蛋白层吸出来就不会有

  心之所向,所向披靡 imingxian 提取 RNA 及用 DEPC 去除 RNase 的个人总结 快速的操作,低温,少量取上清 主要是抽提之后吸取上清时要特别小心,只要不把蛋白层吸出来就不会有 RNase 污染。 克隆第二版 343 页,上关于提取 RNA 所用的玻璃容器的处理方法,是用前 180 度干烤 8 小时或更长时间;另一种方法是 0.1%的 depc 水浸泡(37 度 2 小时), 然后灭菌水淋洗数次,100 度干烤 15 分钟,然后高压灭菌除去 depc.我们实验室一 直是用 170 度考 4 小时,且不准离人,不准过夜,可能是怕烤箱长时间高温,线老 化会发生吧 提取 RNA 所用的枪头,EP 管。直接高压烘干即可。如果用 0.1%DEPC 处理, 要在 DEPC 配置后振摇 1 小时后再浸泡枪头,EP 管方有效。我做的都是将枪头 泡在配制好的 depc 中,摇振过夜,然后倒掉 depc 注意要到干净,再高压,为 了防止仍残留液体可 120 度干烤一会 A.对于提取 RNA 来说,我认为关键的一点在于实验器材的准备.包括从最初的标 本的制备,保存,以及之后的试剂的准备,匀浆器,镊子,tip 头的去除 RNase 处理,尤 其是去除 RNase 的 DEPC 处理步骤 B. 您在处死大鼠前,先准备好干净的冻存管(用 1.5ml 的 Ep 管也可以,就是后面您 在从液氮中取出的时候容易爆,您的注意安全),然后将去除的骨骼肌立即用干净 的剪刀分成半颗到一颗黄豆大小,装入冻存管后立即投入液氮保存.个人认为在这 里使用装标本的管子没必要用 DEPC 处理 C.在提取 RNA 之前,将试剂(TRIzol)和器械(tip 头,镊子,匀浆器)都准备好 D.从液氮取出标本后,立即转移进入事先加入 TRIzol 的匀浆器内(最好置冰上操 作),立即匀浆,一直到标本完全碾磨碎,这个时候 TRIzol 液体成浑浊状,而且匀浆器 的壁上没有太多的黏附组织,然后将 TRIzol 转出,继续后续的步骤. 1 Rnase 是一种蛋白酶,能够降解 RNA。 2 我们的手上皮肤上有很多,应该是对我们的身体起作用。不被 RNA 病毒感染?或者什么的。 3 这个酶高效稳定。要么在 DEPC 水中处理 n 小时,要么在 160 度高温烘烤 6 小时。此酶才会失效。 4 所谓 DEPC,是一种叫做焦碳酸二乙酯的东西。有毒啊。所谓 DEPC 水,一 般指两种状态,a,配制 好未消毒;b,配制好已消毒。通过高压消毒,该物质 会降解,从而无毒。 1 无菌蒸馏水中加入 0.1%(v/v)焦碳酸二乙酯(DEPC),室温搅拌 4 小时以上 至完全溶解,高压灭菌 20 分钟,冷却备用。rna电泳这个是 DEPC 水的 b 状态。 2 如果你要用 DEPC 水处理 Tips 等等东东,那么就要用高压前的水,即 DEPC 水的 a 状态。把枪头管子等完全浸泡至少 8 小时,我一般都是过夜的,或者平 时就泡在里面备用。 RNA 提取必须创造无 RNase 的,所有仪器与试剂均按照以下方法进行处 理 :研钵、研棒、药匙、玻璃器皿等需在 180℃烘干 4h 以上;电泳槽、胶板、 梳子、用 0.1 %~0.2%DEPC 水处理过夜或者用洗涤灵清洗干净后用 0.5%的 SDS (Sodium dodecyl sulte, RNase 的活性)浸泡过夜,然后用 ddH2O 冲洗干净,晾干备用;离心管,枪头等塑料器皿要用 0.1%~0.2%DEPC 水处理 之后(DEPC 有致癌之嫌,须小心操作)。37℃保温 12h 以上,然后高压灭菌,灭 活 DEPC ( Diethypyrocarbonate );溶液都需用经 DEPC 处理过的水配置, RNA 提取的所有操作应尽可能在超净工作台上进行。 我们研究所里提 RNA 用的枪头和 EP 管都是高压两遍的,没有用 DEPC 水处理。 1、 有灭菌过的 DEPC 水,这一般是用来配 75%乙醇用,因为乙醇若高压灭菌 会挥发,所以乙醇是新开封专用的。 2、 没有经高压灭菌的 DEPC 水,这主要是用于配你提 RNA 所用的试剂(所 说的试剂是可以经高压灭菌的),总的来说,都得经过高压灭菌,目的就是要去 除 DEPC,以防止它以随后实验的干扰。 3、 DEPC 处理水:无菌蒸馏水中加入 0.1%(v/v)焦碳酸二乙酯(DEPC),室 温搅拌 4 小时以上,121 度高压灭菌 20 分钟,冷却备用。 凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用 0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC) 水溶液处理,再用蒸馏水冲净。DEPC 是 RNA 酶的化学修饰剂,它和 RNA 酶的活 性基团组氨酸的咪唑环反应而酶活性。DEPC 与氨水溶液混合会产生致癌物, 因而使用时需小心。试验所用试剂也可用 DEPC 处理,加入 DEPC 至 0.1%浓度, 然后剧烈振荡 10 分钟,再煮沸 15 分钟或高压灭菌以消除的 DEPC,否则 DEPC 也能和腺嘌呤作用而 mRNA 活性。但 DEPC 能与胺和巯基反应,因而 含 Tris 和 DTT 的试剂不能用 DEPC 处理。Tris 溶液可用 DEPC 处理的水配制然 后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌,可用 DEPC 处理水配制,并尽可能用未 曾开封的试剂. 为啥在 28s 之后还是有影影约约的片断?和模糊的 ear? 这都与非变性电泳方式有关。RNA 的电泳,严格讲是要使用变性电泳的,我们 平时所知道的 RNA 电泳的知识,实际上都是由变性电泳获得的。但因为非变 性电泳实在是太方便了,同时,就一般检测而言,完全可以替代变性电泳,所 以我们日常检测就都使用非变性电泳了。 电泳时间太长了容易产生降解。最好是在 120V 左右。操作的时候有没有注意戴 口罩和手套,注意,手套要经常换,不要太节约了。那样也会影响 RNA 的质量。 无论你是提什么 RNA 只要是用异丙醇沉淀的,都得用 75%的酒精洗涤一次。 1 样品不要太多,抽提务必充分,室温放置 5min; 2 200ul 氯仿 剧烈振荡 20s,室温放置 2-15min; 3 13000g 离心 15min; 4 取上层水相,一般 400-450ul 就足够了,千万不要贪多!*** 5 加入 500ul 异丙醇 摇匀,室温放置 10min; 6 12000g 离心 10min; 7 75%乙醇 1000ul 洗涤沉淀; 8 7500g 离心 5min;(12000 转速太高了吧,沉淀不容易溶解的) 9 弃乙醇,吸干净的微量乙醇, 室温干燥 3-5min;(时间太久沉淀不易 溶解) 10 适量 DEPC 水溶解沉淀。 电泳的上样量 1ug,电泳 buffer 用 DEPC 处理的水配制,电泳时间不要太久, 95V,10-15min 足够了。 跑 RNA 电泳。先用 2%琼脂糖胶,若分离效果不好,可用甲醛变性胶。在 上样缓冲液中注意加入 RNA 酶。注意观察带形,质量较好的 RNA 亮度。 28S:18S 应为 2:1。还要注意观察,在加样孔或刚出加样孔附近,有没有带, 若 有,rna电泳可能为基因组 DNA 污染。 OD 值只有 1.5,可能为基因组 DNA 污染。参 考一下克隆 3。有 OD 值与污染 DNA 的关系。,酚氯仿抽提后, 上清可少吸一些。提取后的 RNA 样品可用无 RNA 酶的 DNA 酶消化一下。注 意该酶的 buffer 中有一种物质在 OD260 有吸光度,应严格按照其 protocol 操 作,减少误差。 只要用 DEPC 处理过的水,打开一瓶新的无水乙醇(或者专用于 RNA 的,即只 用处理过的枪头取过乙醇的)配就可以了。DEPC 高温高压时变成 CO2 和水, 再加上乙醇也很容易气化,可能是因为有气体产生吧,如果盖子太紧容易发生瓶 子破掉的事情。(我还从来没有听说过把乙醇高温灭菌过)而且,湿热灭菌本身 不足以去除 RNA 酶,所以我觉得有时候,灭菌可能反而引入 RNA 酶污染也不 一定哦 75%的乙醇用于提取 RNA 时最好还是现用现配,乙醇最好是新的且以后不要用 于方面,也就是留一瓶专门用于提取 RNA。DEPC 一般高压灭菌 30 分钟就 可以了! 75%乙醇:灭菌后的千分之一 DEPC 水 25ml 75ml 无水乙醇.配好后装入高温烘 烤的玻璃瓶中(160 干烘四小时),或塑料器皿的用千分之一的 DEPC 泡 12 小 时以上再灭 30 分钟,存放于低温冰箱 4 度保存!!! 倾听,岁月吹奏长笛,叮咚流韵,悠悠靡音。午夜乘鸾,虔念飘洋过海,痴缠驻守天籁,心灵驿站舒馨。 静看月色,锦瑟未央,娇羞情窦初开,醉饮一阙诗经蒹葭。蝶舞翩翩,漫渡凌云,不胜凌波。踏波无浪,携手灵气,惠风庭前守望。 月光盈照,心池微醉,诗意芳华,缠绕穹空,悠然蜗居栖息。一弯柔情似水,秋水无痕。素风掠过心苑,犹如怡景,纤尘不染竹篱。 心事平静安享,唏嘘踏,恬淡悠远,听一天马行空。信鸽滑翔,风翅逍遥,音律穿越,坐拥不老青春。芳菲西楼浣韵,丝织金色笑语,笛箫琴瑟,植于心谷漾溢,盎然灵仙之气。 风舞天涯极光,月下袅娜,醉醒守望蔓坨。心溪谷,一簇芬芳妖娆,跫音,捕捉千里之外。杳杳讯息,铺展羁旅,驾舟,泅渡,渡口者,匆匆驶过天籁。 盈盈月盘,金枝玉叶为媒,凌波旅途迢迢,轻摇浅阶相遇。杯盏,斟下一弯月镰,拂去忧愁烦恼,与云雾朦胧醉卧,与影对饮,翠幽。 独坐春夜,静观夏夜,旖旎秋夜,缱绻冬夜,夜夜,坐拥与你,衣袂飘飘。醉花荫处,一笺风语,沉香,沁脾。那一弯春溪泉涌,吟唱过往清风,心情澄澈,思绪执手填词。聆 听青春嫣然。 梦中一道霓虹,化为亘古琴音。相约午夜,缱绻风景,旖旎浪漫。扯下一苑芳草,萋萋蔓绿,感怀飘然。登程人生,若即若离,云水禅心,未央别具一格。 岁月如斯,了然于胸,与你秉烛执手,问情生命。编辑记忆,跋涉心灵轨迹,如梦鼾声,柔感情怀。走出喧嚣,缘结地荒。待,小荷风情初窦,与天地之,吟咏。 卷壁苍夜,浅笑一弯碧月。谱一阙神曲,载渡。寄语晨时星光,盈照旭日,小鸟伊人,浮光霓裳,晓风过隙,情泻千里,凌霄悄然寄挂。 袅袅炊烟,一宛悠然,馨暖徜徉,花前月下徘徊,天涯无痕。阡陌碧波,幸福瑶池,花枝摇曳,奏一曲天籁吟韵。诗书充盈,短笛横吹,赋旖旎,坐拥,岁月…… 倾听,岁月吹奏长笛,叮咚流韵,悠悠靡音。午夜乘鸾,虔念飘洋过海,痴缠驻守天籁,心灵驿站舒馨。 静看月色,锦瑟未央,娇羞情窦初开,醉饮一阙诗经蒹葭。蝶舞翩翩,漫渡凌云,不胜凌波。踏波无浪,携手灵气,惠风庭前守望。 月光盈照,心池微醉,诗意芳华,缠绕穹空,悠然蜗居栖息。一弯柔情似水,秋水无痕。素风掠过心苑,犹如怡景,纤尘不染竹篱。 心事平静安享,唏嘘踏,恬淡悠远,听一天马行空。信鸽滑翔,风翅逍遥,音律穿越,坐拥不老青春。芳菲西楼浣韵,丝织金色笑语,笛箫琴瑟,植于心谷漾溢,盎然灵仙之气。 风舞天涯极光,月下袅娜,醉醒守望蔓坨。心溪谷,一簇芬芳妖娆,跫音,捕捉千里之外。杳杳讯息,铺展羁旅,驾舟,泅渡,渡口者,匆匆驶过天籁。 盈盈月盘,金枝玉叶为媒,rna电泳凌波旅途迢迢,轻摇浅阶相遇。杯盏,斟下一弯月镰,拂去忧愁烦恼,与云雾朦胧醉卧,与影对饮,翠幽。 独坐春夜,静观夏夜,旖旎秋夜,缱绻冬夜,夜夜,坐拥与你,衣袂飘飘。醉花荫处,一笺风语,沉香,沁脾。那一弯春溪泉涌,吟唱过往清风,心情澄澈,思绪执手填词。聆 听青春嫣然。 梦中一道霓虹,化为亘古琴音。相约午夜,缱绻风景,旖旎浪漫。扯下一苑芳草,萋萋蔓绿,感怀飘然。登程人生,若即若离,云水禅心,未央别具一格。 岁月如斯,了然于胸,与你秉烛执手,问情生命。编辑记忆,跋涉心灵轨迹,如梦鼾声,柔感情怀。走出喧嚣,缘结地荒。待,小荷风情初窦,与天地之,吟咏。 卷壁苍夜,浅笑一弯碧月。谱一阙神曲,载渡。寄语晨时星光,盈照旭日,小鸟伊人,浮光霓裳,晓风过隙,情泻千里,凌霄悄然寄挂。 袅袅炊烟,一宛悠然,馨暖徜徉,花前月下徘徊,天涯无痕。阡陌碧波,幸福瑶池,花枝摇曳,奏一曲天籁吟韵。诗书充盈,短笛横吹,赋旖旎,坐拥,岁月……

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